Einleitung
Die entscheidenden Bestandteile von Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) und seinen Metaboliten bei Alterung und Neurodegeneration sind weithin anerkannt. Um den Fortschritt in Richtung biochemischer Forschung und Interventionen zur Bekämpfung des Alterns und neurodegenerativer Erkrankungen voranzutreiben, ist es von großer Bedeutung, NAD+ und seine Metabolitenspiegel im NAD+-Salvage-Signalweg genau zu quantifizieren. Hier wird eine robuste und genaue LC-MS/MS-Methode angewendet, um die Spiegel von NAD+ und seinen Metaboliten im normalen und verletzten Ischiasnerv der Maus zu quantifizieren.
Grenzen bestehender Methoden zur Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten
Traditionelle Methoden zur Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten, wie z. B. HPLC-UV, NMR, Kapillarzonenelektrophorese oder kolorimetrische enzymatische Assays, stehen vor verschiedenen Herausforderungen in Bezug auf Sensitivität, Selektivität und indirekte Messung. Was die bestehenden LC-MS/MS-Assays für zelluläre oder Gewebe-NAD+- und seine Metabolitenmessungen betrifft, so gibt es noch viele Schwierigkeiten zu überwinden, wie z. B. verlängerte Laufzeiten, schlechtes chromatographisches Retentionsverhalten und unbefriedigende Peakformen. Darüber hinaus können nur ein bis drei Substanzen des NAD+-Salvage-Pfades mit diesen Methoden abgedeckt werden.
Die Modifikationen der LC-MS/MS-Methode
Auf der Grundlage bestehender LC-MS/MS-Assays werden die Modifikationen hinsichtlich der chromatographischen Bedingungen, der Surrogatmatrix und der MS/MS-Bedingungen durchgeführt. Konkret werden 5 μM Methylenphosphonsäure als Additiv für die mobile Phase verwendet, das die Signalintensität und die Peakform explizit fördert. Aufgrund der relativ sauberen und einfachen Natur der Proben und ihrer geringen Größe wird Reinstwasser als Ersatzmatrix getestet. Anstelle einer hydrophilen Interaktionsflüssigkeitschromatographie-Säule und einer Hypercarb-Säule wird die Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-Säule verwendet, deren einzigartige MaxPeak HPS-Hochleistungsoberflächentechnologie (Passivierung der Säuleninnenwand, Eliminierung der Metalloberfläche) die hohe Reproduzierbarkeit, Peaksymmetrie und Basislinientrennung aller Analyten ermöglicht. Darüber hinaus sind die MS-Bedingungen optimiert, um das NAD+-Störsignal im Kanal der zyklischen Adenosindiphosphat-Ribose (cADPR) zu minimieren und gleichzeitig die Reaktion von cADPR und Nicotinamid-Mononukleotid (NMN) beizubehalten, mit 4000 V für die Ionensprühspannung, 450 °C für die Temperatur des Turboheizers, 50 psi für Gas 1, 50 psi für Gas 2, 30 psi für Vorhanggas und 12 psi für Kollisionsgas.
Repräsentatives Chromatogramm von Nervenproben (normal vs. verletzt)
Alle fünf Analyten erreichen eine Baseline-Trennung, wobei cADPR ein empfindlicher Biomarker im Neurodegenerationsmodell ist. Dabei induziert die Axotomie des Ischiasnervs eine axonale Degeneration, die zu einem reduzierten NAD+-Spiegel und einem erhöhten NMN-Spiegel in den verletzten Nerven führt, was zu einer etwa 2-fachen Erhöhung des NMN/NAD+-Verhältnisses führt. Gleichzeitig werden die Spiegel von Nicotinamid (NAM) und Adenosindiphosphat-Ribose (ADPR) um etwa das 2-fache gesenkt, während der cADPR-Spiegel um mehr als das 8-fache erhöht wird. Diese Ergebnisse stimmen mit denen früherer Forschungsergebnisse überein und bestätigen die Genauigkeit dieser modifizierten LS-MS/MS-Methode bei der Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten.
Schlussfolgerung
Diese modifizierte LC-MS/MS-Methode ermöglicht eine effektive Ausgangstrennung von NAD+, NMN, NAM, ADPR und cADPR innerhalb einer kurzen Laufzeit von 5 Minuten, was zur Frühdiagnose verschiedener neurologischer Erkrankungen und zur Medikamentenentwicklung für das Altern und neurodegenerative Erkrankungen beiträgt.
Referenz
Entwicklung und Validierung einer LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von NAD+ und verwandten Metaboliten in Ischiasnerven von Mäusen und deren Anwendung auf ein Tiermodell für Nervenverletzungen. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821
BONTAC NAD
BONTAC widmet sich seit 2012 der Forschung und Entwicklung, der Herstellung und dem Vertrieb von Rohstoffen für Coenzyme und Naturprodukte mit eigenen Fabriken, über 170 globalen Patenten sowie einem starken Forschungs- und Entwicklungsteam. BONTAC verfügt über umfangreiche F&E-Erfahrung und fortschrittliche Technologie in der Biosynthese von NAD und seinen Vorläufern (z. NMN und NR). Es stehen verschiedene Arten von NAD zur Auswahl, darunter NAD ER Grade (Endoxinentfernung), NAD Grade I (IVD/Nahrungsergänzungsmittel/kosmetisches Rohpulver), NAD Grade II (API/Zwischenprodukte) und NAD Grade IV (falls höhere Anforderungen an die Löslichkeit bestehen), die in Form von lyophilisiertem Pulver oder kristallinem Pulver bereitgestellt werden können. Die Reinheit von BONTAC NAD kann über 98% erreichen.
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