Wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering durch Manipulation der Redox-Cofaktor-Regeneration

Eine immer breitere Palette von Chemikalien wird heute biotechnologisch aus nachwachsenden Rohstoffen hergestellt. Bioprozesse sind für die effiziente Herstellung dieser Verbindungen stark auf die enzymatische Katalyse angewiesen. Sicherzustellen, dass Enzyme in ihrer gewünschten Umgebung optimal funktionieren, ist daher von großem Interesse für eine nachhaltige Produktion.

Eigenschaften wie Substratspezifität, katalytische Geschwindigkeit und (Thermo-)Stabilität gehören zu mehreren kritischen Faktoren, die für effiziente enzymgetriebene Bioprozesse optimiert werden müssen. Diese Optimierung kann zeitaufwendig, kostspielig und herausfordernd sein, und daher sind effektive und kosteneffiziente Wege für die wachstumsgekoppelte Selektion wahrscheinlich, technische Enzyme mit wünschenswerten Eigenschaften sind sehr gefragt.

Die Vorteile der Verwendung der wachstumsgekoppelten Selektion als eine Form der Enzymselektion, bei der die Aktivität eines Enzyms mit dem Wachstum einer Zelle verknüpft wird. Diese Methode kann als Hochdurchsatz-Selektionsstrategie verwendet werden und kann erreicht werden, indem entweder sichergestellt wird, dass das Wachstum von der Produktsynthese durch das Zielenzym abhängt, oder indem die Aktivität des Enzyms mit dem globalen Energiezustand der Zelle verknüpft wird. Synthetische Biologie kann verwendet werden, um Stämme zu entwickeln, die für die wachstumsgekoppelte Selektion geeignet sind, und jüngste Fortschritte haben sich auf technische Stämme konzentriert, denen die oxidierten oder reduzierten Zustände von Redox-Cofaktor-Paaren fehlen, die als Enzym-Engineering-Plattformen dienen können. Der Einsatz dieser Plattformen kann die Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren und Bioprozesse beschleunigen.

Vorteile der Wachstumskopplung über Cofaktor-Auxotrophie

Die Vorteile der Verwendung von Cofaktor-Auxotrophie als Auswahlmethode für die Entwicklung von Enzymen, die an der Biosynthese bestimmter Chemikalien wie Lipide, Biokraftstoffe, Gase, organische Lösungsmittel oder polymere Verbindungen beteiligt sind. Dieser Ansatz bietet mehrere einzigartige Vorteile, einschließlich der Möglichkeit, das gewünschte Produkt unabhängig vom Substrat oder Produkt von Interesse auszuwählen, was es einfacher macht, eine verbesserte enzymatische Aktivität zu erkennen, und eine Anzeige für den Nachweis einer verbesserten enzymatischen Aktivität bietet. Darüber hinaus ist die Verwendung von Cofaktor-Auxotrophen als Wachstumskopplungsplattformen von Vorteil, da die allgegenwärtige Natur von Redox-Cofaktoren im mikrobiellen Stoffwechsel bedeutet, dass Engineering-Strategien lateral auf andere Mikroben von Interesse übertragbar sind und Enzyme direkt in der Umgebung des gewünschten mikrobiellen Wirts hergestellt werden können. (dargestellt als Abbildung 1)

Abbildung 1: Vergleich mehrerer weit verbreiteter Screening-/Selektionstechniken für das Enzym-Engineering

Mutanten mit Mangel an NADH-Oxidation

Die Oxidation von NADH in E. coli kann auf zwei Wegen erfolgen, abhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit. Unter aeroben Bedingungen wird NADH hauptsächlich durch Atmung oxidiert, um ATP zu erzeugen, während es unter anaeroben Bedingungen durch Fermentationswege oxidiert werden kann, um Laktat und Ethanol zu produzieren. Mutierte Stämme von E. coli, die nicht in der Lage sind, gemischte Fermentationswege für die NADH-Oxidation während des anaeroben Wachstums zu verwenden, wurden verwendet, um NADH-Oxidationswege für die anaerobe Synthese verschiedener Chemikalien wie 2-Methylpropan-1-ol, 2,3-Butandiol, 1-Butanol und L-Alanin voranzutreiben. Diese mutierten Stämme wurden auch verwendet, um Enzyme zu entwickeln, indem ähnliche Redoxprinzipien ausgenutzt wurden, was zu verbesserten Varianten führte. Die resultierenden Stämme können verwendet werden, um andere NAD(P)H-abhängige Enzyme und Signalwege zu entwickeln.

Mutanten mit Mangel an NAD+-Reduktion

Wenk et al. schufen einen E. coli-Stamm, indem sie das Dihydrolipoyl-Dehydrogenase-Gen (lpd) löschten, was dazu führte, dass der Stamm aufgrund der fehlenden Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität keine reduzierende Kraft (NADH und NADPH) aus dem Acetatstoffwechsel erzeugen konnte. Dies führte dazu, dass der Stamm eine Auxotrophie zur Verringerung der Leistung zeigte, wenn er aerob auf Acetat als alleiniger Kohlenstoffquelle gezüchtet wurde. (dargestellt als Abbildung 2) Der Stamm konnte auf Acetat wachsen, wenn er mit oberen glykolytischen Substraten ergänzt wurde oder NAD+-abhängige Formiat-, Ethanol- oder Methanoldehydrogenasen mit ihren jeweiligen Substraten exprimierte. Der Stamm wurde nicht für das Enzym-Engineering verwendet und nur auf Redox-Cofaktor-Auxotrophie untersucht.
 

Abbildung 2: Zentraler Stoffwechsel

Mutanten mit Mangel an NADPH-Oxidation

Es gibt zwei verschiedene Strategien zur Induktion von NADP+-Auxotrophie in E. coli, die sich auf die Entwicklung des glykolytischen Wegs zur Überproduktion von NADPH stützen. Die erste Strategie besteht darin, das native gapA-Gen zu löschen und ein heterologes NADP+-abhängiges GAPDH-Enzym zu exprimieren, während die zweite Strategie die Umleitung des Kohlenstoffflusses durch den Pentosephosphatweg beinhaltet. Die resultierenden Stämme sind nicht in der Lage, auf Glukose zu wachsen, zeigen aber Wachstum unter verschiedenen Bedingungen, wobei der erste Stamm unter anaeroben Bedingungen und der zweite unter aeroben Bedingungen mit Glycerin als Substrat gewachsen ist. Diese Stämme werden für die Entwicklung von Enzymen mit verbesserten Eigenschaften verwendet, einschließlich Substratspezifität, katalytischer Aktivität und Thermostabilität.

Mutanten mit Mangel an NADP+-Reduktion

Drei verschiedene Bakterien, E. coli, P. putida und C. glutamicum, wurden so konstruiert, dass sie NADPH-auxotroph sind, was bedeutet, dass sie exogenes NADPH für das Wachstum benötigen. Im Fall von E. coli und C. glutamicum wurden zentrale metabolische Enzyme ausgeschaltet, um eine NADP+-Reduktion zu vermeiden, wenn Glukose als Kohlenstoffquelle bereitgestellt wurde, während in P. putida CRISPR / nCas9-gestütztes Engineering verwendet wurde, um Sätze von Zielgenen sequentiell zu stören, um ihre Beteiligung am Redoxstoffwechsel zu verstehen. Die NADPH-auxotrophen Stämme wurden dann für das wachstumsgekoppelte Enzym-Engineering basierend auf der Cofaktor-Spezifität verwendet. Eine einzige Mutagenese-Runde mit E. coli ergab die bisher effizienteste und spezifischste NADP+-abhängige Formiat-Dehydrogenase, während P. putida und C. glutamicum die ersten Stämme ihrer Spezies darstellen, die für diese Art von Engineering verwendet werden können.

Mutanten mit Mangel an NMN+-Reduktion

Ein wachstumsgekoppeltes Selektionssystem wurde entwickelt, um Cofaktor-Zyklen und Wachstum basierend auf einem Mangel an NMN+-Reduktion zu verknüpfen. Es wurde der E. coli SHuffle-Stamm verwendet, der Deletionen in zwei Genen trägt, die an der Produktion von reduziertem Glutathion beteiligt sind. Eine NMNH-abhängige Glutathionreduktase wurde durch rationale Mutagenese entwickelt, um den Prozess mit dem NMN + / NMNH-Zyklus zu verbinden, und eine NMN + -abhängige Glukosedehydrogenase wurde verwendet, um den NMN + / NMNH-Cofaktorzyklus und damit das Wachstum zu unterstützen. Die Studie wandte erstmals auch nicht-kanonische Redox-Cofaktor-Auxotrophie für wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering an, was zu einer thermostabilen Phosphit-Dehydrogenase-Variante mit verbesserter katalytischer Effizienz und zeitlicher Stabilität in vitro führte. Die Arbeit liefert einen nützlichen Stamm für das wachstumsgekoppelte Enzym-Engineering, abhängig von NMN + / NMNH-Zyklen und auxotroph für den reduzierten Zustand eines nicht-kanonischen Redox-Cofaktors.

 

Das Potenzial der Wachstumskopplung über Redox-Cofaktoren war ein leistungsfähiges Werkzeug für die Entwicklung von Biokatalysatoren, insbesondere im Kontext einer nachhaltigen Bioproduktion. Obwohl beträchtliche Fortschritte bei der Erzeugung von Redox-Cofaktor-Auxotrophstämmen erzielt wurden, deutet die Aussage darauf hin, dass es noch mehrere unerforschte Wege für die Forschung gibt. Eine davon beinhaltet die Entwicklung von Cofaktor-Auxotrophen Stämmen anderer Organismen als E. coli, die neue Möglichkeiten für das wachstumsgekoppelte Enzym-Engineering eröffnen könnten.

Insgesamt deutet es darauf hin, dass die Verwendung von Redox-Cofaktor-basierter Wachstumskopplung eine große Chance für die technische Biokatalyse darstellt, insbesondere für die Herstellung von Produkten, die die Anforderungen anderer Hochdurchsatz-Enzym-Engineering-Ansätze nicht erfüllen können. Er unterstreicht die Notwendigkeit, vielseitigere und effizientere Biokatalysatoren für eine nachhaltige Bioproduktion zu entwickeln, und unterstreicht die Bedeutung kontinuierlicher Forschung in diesem Bereich.


Referenz: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Growth-coupled enzyme engineering through manipulation of redox cofactor regeneration, Biotechnology Advances, 2023.