Die Optimierung der Reaktionsbedingungen zur Erzielung einer hohen Ausbeute an Stevia-Rebaudiosid D
Eine zuckerreiche Ernährung hat zu einer steigenden Prävalenz verschiedener chronischer Krankheiten geführt, darunter Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Bluthochdruck, was ein erhebliches globales Problem für die öffentliche Gesundheit darstellt. Stevia Rebaudiosid D (Reb D), ein natürlicher Süßstoff aus Pflanzen, hat aufgrund seines kalorienfreien Gehalts, seiner intensiven Süße und seines angenehmen Geschmacksprofils als Zuckerersatz große Aufmerksamkeit erregt.
Sein begrenztes Vorkommen in Stevia rebaudiana Bertoni und die Herausforderungen im Zusammenhang mit der geringen Löslichkeit und enzymatischen Aktivität der pflanzlichen Glykosyltransferase haben jedoch ihre breite kommerzielle Anwendung behindert. Als Reaktion auf diese Probleme wurde eine neuartige Glykosyltransferase namens YojK entdeckt, die aus Bacillus subtilis 168 stammt. In dieser Studie wird eine genetisch modifizierte bakterielle Glykosyltransferase, YojK-I241T/G327N, vorgestellt, die sich durch hohe Löslichkeit und katalytische Effizienz auszeichnet und ein großes Potenzial für die Herstellung von Reb D im industriellen Maßstab bietet.
Die Entwicklung einer hocheffizienten Methode zur Herstellung von Rebaudiosid D unter Verwendung einer Kaskadenreaktion von YojK-I241T/G327N und AtSuSy-Enzymen.
Um das Problem der geringen Löslichkeit in pflanzlichen Glykosyltransferasen anzugehen, untersuchten die Forscher das Potenzial der Verwendung von YojK, einer O-Glykosyltransferase aus Bacillus subtilis 168. YojK wurde aufgrund seiner nachgewiesenen Glykosylierungsaktivität mit verschiedenen Substraten, einschließlich großer Moleküle, ausgewählt. Nach erfolgreicher rekombinanter Expression und Reinigung wurde YojK verwendet, um Reb A zu glykylieren, was zur Produktion von Stevia Reb D führte. Die kinetische Analyse von Enzymen ergab, dass YojK im Vergleich zu anderen Glykosyltransferasen eine geringere katalytische Aktivität gegenüber Reb D aufweist. Folglich deutet die Studie auf die Notwendigkeit von strukturgeführtem Engineering hin, um die katalytische Aktivität von YojK für potenzielle praktische Anwendungen zu verbessern. (wie in Abbildung 1 dargestellt)
Abbildung 1
Die Optimierung der Reaktionsbedingungen, um eine hohe Ausbeute an Rebaudiosid D zu erreichen.
Die Reaktionsbedingungen, einschließlich pH-Wert, Temperatur und Substratkonzentration, können optimiert werden, um eine hohe Ausbeute an Srevia Reb D zu erzielen. In der Studie wurden Molekulardynamik-Simulationen verwendet, um zu untersuchen, wie die YojK-I241T/G327N-Variante die Glykosylierung von Reb D verbessert. Die Variante behielt während der Simulationen eine stabile Wasserstoffbrückenbindung zwischen Reb A und H14 bei, im Gegensatz zum Wildtyp (wie in Abbildung 2 dargestellt). Diese Stabilität erstreckte sich auch auf den Abstand zwischen dem O2-Atom von Reb A und dem C1P von UDPG. Die verbesserte katalytische Effizienz der YojK-I241T/G327N-Variante wurde auf diese stabilen Wechselwirkungen zurückgeführt, was auf ihr praktisches Potenzial hindeutet.
Abbildung 2
Abbildung 3
Schlussfolgerung
Dieser Ansatz ergab 83,47 % Reb D. Insbesondere die Zugabe von 1 mM UDPG ermöglichte die Synthese von 20,59 g/L Reb D mit einer bemerkenswerten Ausbeute von 91,29 %, was frühere Studien übertraf. Dieses Verfahren demonstriert das Potenzial für die Produktion von Reb D im industriellen Maßstab, insbesondere nach der Tragwerksplanung von YojK.YojK kann effizient in E. coli BL21 (DE3) mit hoher Löslichkeit exprimiert werden. Durch strukturgesteuertes Engineering wurde eine Doppelmutante, YojK-I241T/G327N, geschaffen, die die Produktion von Reb D in großem Maßstab mit einer außergewöhnlichen Ausbeute von 91,29 % durch das Recycling von UDPG ermöglicht, das durch die Saccharosesynthase AtSuSy katalysiert wird. In dieser Studie wird YojK-I241T/G327N als vielversprechendes Werkzeug für die wirtschaftlich effektive Reb D-Produktion im industriellen Maßstab vorgestellt.
