Wachstumsgekoppelte Enzymtechnik durch Manipulation der Regeneration von Redox-Kofaktoren

Eine immer größere Palette von Chemikalien wird nun aus erneuerbaren Rohstoffen durch biotechnologische Mittel hergestellt. Bioprozesse sind stark auf enzymatische Katalyse angewiesen, um diese Verbindungen effizient zu produzieren. Daher ist es von großem Interesse für eine nachhaltige Produktion sicherzustellen, dass Enzyme in ihrer benötigten Umgebung optimal funktionieren.

Eigenschaften wie Substratspezifität, katalytische Rate und (thermo)stabilität gehören zu mehreren entscheidenden Faktoren, die für effiziente, enzymgetriebene Bioprozesse optimiert werden müssen. Diese Optimierung kann zeitaufwendig, kostspielig und herausfordernd sein und daher effektive und kosteneffiziente Wege für wachstumsgekoppelte Auswahl sein; Ingenieur-Enzyme mit wünschenswerten Eigenschaften sind sehr gefragt.

Die Vorteile der wachstumsgekoppelten Selektion als Form der Enzymselektion, bei der die Aktivität eines Enzyms mit dem Wachstum einer Zelle verknüpft wird. Diese Methode kann als Hochdurchsatz-Selektionsstrategie verwendet werden und kann erreicht werden, indem entweder sichergestellt wird, dass das Wachstum von der Produktsynthese des Zielenzyms abhängt, oder indem die Aktivität des Enzyms mit dem globalen Energiezustand der Zelle verknüpft wird. Synthetische Biologie kann verwendet werden, um Stämme zu konstruieren, die sich für wachstumsgekoppelte Auswahl eignen, und jüngste Fortschritte konzentrieren sich auf das Engineering von Stämmen, die in den oxidierten oder reduzierten Zuständen von Redox-Kofaktorpaaren defizitieren, welche als Enzym-Engineering-Plattformen dienen können. Der Einsatz dieser Plattformen kann die Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren und Bioprozesse beschleunigen.

Vorteile der Wachstumskopplung über Kofaktor-Auxotrophie

Die Vorteile der Verwendung von Cofaktor-Auxotrophie als Auswahlmethode für die Entwicklung von Enzymen, die an der Biosynthese bestimmter Chemikalien beteiligt sind, wie Lipide, Biokraftstoffe, Gase, organische Lösungsmittel oder polymere Verbindungen. Dieser Ansatz bietet mehrere einzigartige Vorteile, darunter die Möglichkeit, das gewünschte Produkt unabhängig vom Substrat oder Produkt auszuwählen, erleichtert die Erkennung verbesserter enzymatischer Aktivität und bietet eine Anzeige zur Erkennung verbesserter enzymatischer Aktivität. Darüber hinaus ist der Einsatz von Cofaktor-Auxotrophen als Wachstumskopplungsplattformen vorteilhaft, da die allgegenwärtige Natur von Redox-Cofaktoren im mikrobiellen Stoffwechsel bedeutet, dass Engineering-Strategien lateral auf andere relevante Mikroben übertragen werden können und Enzyme direkt in der Umgebung des gewünschten mikrobiellen Wirts konstruiert werden können. (dargestellt als Abbildung 1)

Abbildung 1: Vergleich mehrerer weit verbreiteter Screening-/Selektionstechniken für die Enzymtechnik

Mutanten mit einem Mangel an NADH-Oxidation

Die Oxidation von NADH in E. coli kann je nach Sauerstoffverfügbarkeit auf zwei Wegen erfolgen. Unter aeroben Bedingungen wird NADH hauptsächlich durch Atmung oxidiert, um ATP zu erzeugen, während es unter anaeroben Bedingungen durch Fermentationswege zur Bildung von Laktat und Ethanol oxidiert werden kann. Mutierte Stämme von E. coli, die während anaeroben Wachstums keine gemischten Fermentationswege für NADH-Oxidation nutzen können, wurden eingesetzt, um NADH-Oxidationswege für die anaerobe Synthese verschiedener Chemikalien wie 2-Methylpropan-1-ol, 2,3-Butanediol, 1-Butanol und L-Alanin zu steuern. Diese mutierten Stämme wurden auch zur Entwicklung von Enzymen verwendet, indem ähnliche Redoxprinzipien genutzt wurden, was zu verbesserten Varianten führte. Die resultierenden Stämme können verwendet werden, um andere NAD(P)H-abhängige Enzyme und Wege zu entwickeln.

Mutanten mit Mangel an NAD+-Reduktion  

Wenk et al. schufen einen E.-coli-Stamm, indem sie das Dihydrolipoyldehydrogenase-(LPD)-Gen entfernten, was dazu führte, dass der Stamm aufgrund fehlender Pyruvatdehydrogenase-Aktivität keine reduzierende Energie (NADH und NADPH) aus dem Acetatstoffwechsel erzeugen konnte. Dies führte dazu, dass der Stamm Auxotrophie zeigte, um die Leistung zu reduzieren, wenn er aerob auf Acetat als einzige Kohlenstoffquelle angebaut wurde. (dargestellt als Abbildung 2) Der Stamm konnte auf Acetat wachsen, wenn er mit oberen glykolytischen Substraten ergänzt oder NAD+-abhängige Format-, Ethanol- oder Methanoldehydrogenasen mit ihren jeweiligen Substraten exprimierte. Der Stamm wurde nicht für die Enzymtechnik verwendet und nur auf Redox-Kofaktor-Auxotrophie untersucht.
 

Abbildung 2: Zentraler Stoffwechsel 

Mutanten, die an NADPH-Oxidation mangeln

Es gibt zwei verschiedene Strategien, um NADP+-Auxotrophie bei E. coli zu induzieren, wobei der glykolytische Weg so manipuliert wird, dass NADPH überproduziert wird. Die erste Strategie besteht darin, das native GapA-Gen zu löschen und ein heterologes, NADP+-abhängiges GAPDH-Enzym zu exprimieren, während die zweite Strategie die Umleitung des Kohlenstoffflusses über den Pentosphosphatweg beinhaltet. Die resultierenden Stämme können nicht mit Glukose wachsen, zeigen aber Wachstum unter anderen Bedingungen, wobei der erste Stamm unter anaeroben Bedingungen und der zweite unter aeroben Bedingungen mit Glycerol als Substrat wächst. Diese Stämme werden verwendet, um Enzyme mit verbesserten Eigenschaften zu entwickeln, darunter Substratspezifität, katalytische Aktivität und Thermostabilität.

Mutanten mit Mangel an NADP+-Reduktion

Drei verschiedene Bakterien, E. coli, P. putida und C. glutamicum, wurden so entwickelt, dass sie NADPH-auxotroph sind, was bedeutet, dass sie exogenes NADPH für das Wachstum benötigen. Im Fall von E. coli und C. glutamicum wurden zentrale metabolische Enzyme ausgeschaltet, um eine NADP+-Reduktion zu vermeiden, wenn Glukose als Kohlenstoffquelle bereitgestellt wurde, während bei P. putida CRISPR/nCas9-unterstützte Technik eingesetzt wurde, um Zielgene sequentiell zu stören und deren Beteiligung am Redoxstoffwechsel zu verstehen. Die NADPH-auxotrophen Stämme wurden dann für die wachstumsgekoppelte Enzymtechnik auf Basis der Kofaktorspezifität verwendet. Eine einzelne Mutagenese-Runde mit E. coli ergab die bisher effizienteste und spezifischste NADP+-abhängige Formiade-Dehydrogenase, während P. putida und C. glutamicum die ersten Stämme ihrer Art darstellen, die für diese Art verwendet werden können.

Mutanten mit einem Mangel an NMN+-Reduktion

Ein wachstumsgekoppeltes Selektionssystem wurde entwickelt, um Kofaktorzyklen und Wachstum basierend auf einem Mangel an NMN+-Reduktion zu verknüpfen. Der E. coli SHuffle-Stamm wurde verwendet, der Deletionen in zwei Genen enthält, die an der Produktion von reduziertem Glutathion beteiligt sind. Eine NMNH-abhängige Glutathionreduktase wurde durch rationale Mutagenese entwickelt, um den Prozess mit NMN+/NMNH-Zyklen zu verknüpfen, und eine NMN+-abhängige Glukosedehydrogenase wurde verwendet, um den NMN+/NMNH-Kofaktorzyklus und damit das Wachstum zu unterstützen. Die Studie setzte außerdem erstmals nicht-kanonische Redox-Kofaktor-Auxotrophie für wachstumsgekoppelte Enzymtechnik ein, was zu einer thermostabilen Phosphitdehydrogenase-Variante mit verbesserter katalytischer Effizienz und zeitlicher Stabilität in vitro führte. Die Arbeit liefert einen nützlichen Stamm für die wachstumsgekoppelte Enzymtechnik, der auf NMN+/NMNH-Zyklen basiert und für den reduzierten Zustand eines nicht-kanonischen Redox-Kofaktors auxotroph ist.

Das Potenzial der Wachstumskopplung über Redox-Cofaktoren war ein mächtiges Werkzeug zur Entwicklung von Biokatalysatoren, insbesondere im Kontext nachhaltiger Bioproduktion. Obwohl bei der Erzeugung von Redox-Cofaktor-Auxotrophen Stämmen erhebliche Fortschritte erzielt wurden, legt die Aussage nahe, dass es noch mehrere unerforschte Forschungswege gibt. Eine davon beinhaltet die Entwicklung kofaktorischer auxotropher Stämme von anderen Organismen als E. coli, was neue Möglichkeiten für wachstumsgekoppelte Enzymtechnik eröffnen könnte.

Insgesamt legt er nahe, dass der Einsatz von Redox-Kofaktor-basierter Wachstumskopplung eine große Chance für die technische Biokatalyse darstellt, insbesondere für die Herstellung von Produkten, die die Anforderungen anderer Hochdurchsatz-Enzym-Engineering-Ansätze nicht erfüllen können. Es betont die Notwendigkeit, vielseitigere und effizientere Biokatalysatoren für nachhaltige Bioproduktion zu entwickeln, und unterstreicht die Bedeutung fortgesetzter Forschung in diesem Bereich.


Literatur: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang A, Wachstumsgekoppelte Enzymtechnik durch Manipulation der Regeneration von Redox-Cofaktoren, Biotechnology Advances, 2023.