Wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering durch Manipulation der Regeneration von Redox-Cofaktoren
Wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering durch Manipulation der Regeneration von Redox-Cofaktoren
Eine immer breitere Palette von Chemikalien wird heute aus erneuerbaren Rohstoffen durch biotechnologische Verfahren hergestellt. Bioprozesse stützen sich stark auf enzymatische Katalyse für die effiziente Produktion dieser Verbindungen. Die Sicherstellung, dass Enzyme in ihrer erforderlichen Umgebung optimal funktionieren, ist daher für eine nachhaltige Produktion von großem Interesse.
Eigenschaften wie Substratspezifität, katalytische Rate und (Thermo-)Stabilität gehören zu den kritischen Faktoren, die für effiziente enzymgetriebene Bioprozesse optimiert werden müssen. Diese Optimierung kann zeitaufwendig, kostspielig und herausfordernd sein, und daher sind effektive und kosteneffiziente Wege, die wahrscheinlich für wachstumsgekoppelte Selektion und das Engineering von Enzymen mit wünschenswerten Eigenschaften geeignet sind, sehr gefragt.
Die Vorteile der Verwendung wachstumsgekoppelter Selektion als eine Form der Enzymselektion, die die Aktivität eines Enzyms mit dem Wachstum einer Zelle verbindet. Diese Methode kann als Hochdurchsatz-Selektionsstrategie verwendet werden und kann erreicht werden, indem entweder sichergestellt wird, dass das Wachstum von der Produktsynthese durch das Zielenzym abhängt, oder indem die Aktivität des Enzyms mit dem globalen Energiestatus der Zelle verknüpft wird. Synthetische Biologie kann verwendet werden, um Stämme zu entwickeln, die für wachstumsgekoppelte Selektion geeignet sind, und jüngste Fortschritte haben sich auf die Entwicklung von Stämmen konzentriert, die in den oxidierten oder reduzierten Zuständen von Redox-Cofaktor-Paaren defizient sind, die als Enzym-Engineering-Plattformen dienen können. Die Verwendung dieser Plattformen kann die Entwicklung verbesserter Biokatalysatoren und Bioprozesse beschleunigen.
Vorteile der Wachstumskopplung durch Cofaktor-Auxotrophie
Die Vorteile der Verwendung von Cofaktor-Auxotrophie als Selektionsmethode für das Engineering von Enzymen, die an der Biosynthese bestimmter Chemikalien wie Lipiden, Biokraftstoffen, Gasen, organischen Lösungsmitteln oder polymeren Verbindungen beteiligt sind. Dieser Ansatz bietet mehrere einzigartige Vorteile, einschließlich der Fähigkeit, für das gewünschte Produkt unabhängig vom Substrat oder Produkt von Interesse zu selektieren, was die Erkennung verbesserter enzymatischer Aktivität erleichtert und einen Auslesewert für die Erkennung verbesserter enzymatischer Aktivität bietet. Darüber hinaus ist die Verwendung von Cofaktor-Auxotrophen als Wachstumskopplungsplattformen vorteilhaft, da die allgegenwärtige Natur von Redox-Cofaktoren im mikrobiellen Stoffwechsel bedeutet, dass Engineering-Strategien lateral auf andere Mikroben von Interesse übertragbar sein können und Enzyme direkt in der Umgebung des gewünschten mikrobiellen Wirts entwickelt werden können. (wie in Abbildung 1 gezeigt)
Abbildung 1: Vergleich mehrerer weit verbreiteter Screening-/Selektionstechniken für Enzym-Engineering
Mutanten mit Defizienz in der NADH-Oxidation
Die Oxidation von NADH in E. coli kann über zwei Wege erfolgen, abhängig von der Sauerstoffverfügbarkeit. Unter aeroben Bedingungen wird NADH hauptsächlich durch Atmung oxidiert, um ATP zu erzeugen, während es unter anaeroben Bedingungen durch Fermentationswege oxidiert werden kann, um Laktat und Ethanol zu produzieren. Mutantenstämme von E. coli, die während des anaeroben Wachstums nicht in der Lage sind, gemischte Fermentationswege für die NADH-Oxidation zu nutzen, wurden verwendet, um NADH-oxidierende Wege für die anaerobe Synthese verschiedener Chemikalien wie 2-Methylpropan-1-ol, 2,3-Butandiol, 1-Butanol und L-Alanin anzutreiben. Diese Mutantenstämme wurden auch verwendet, um Enzyme durch Ausnutzung ähnlicher Redox-Prinzipien zu entwickeln, was zu verbesserten Varianten führte. Die resultierenden Stämme können verwendet werden, um andere NAD(P)H-abhängige Enzyme und Wege zu entwickeln.
Mutanten mit Defizienz in der NAD+-Reduktion
Wenk et al. erzeugten einen E. coli-Stamm durch Deletion des Dihydrolipoyl-Dehydrogenase (lpd)-Gens, was dazu führte, dass der Stamm aufgrund des Fehlens der Pyruvat-Dehydrogenase-Aktivität nicht in der Lage war, reduzierende Kraft (NADH und NADPH) aus dem Acetatstoffwechsel zu erzeugen. Dies führte dazu, dass der Stamm bei aerobem Wachstum auf Acetat als einziger Kohlenstoffquelle eine Auxotrophie für reduzierende Kraft zeigte. (wie in Abbildung 2 gezeigt) Der Stamm konnte auf Acetat wachsen, wenn er mit oberen glykolytischen Substraten ergänzt wurde oder wenn NAD+-abhängige Formiat-, Ethanol- oder Methanol-Dehydrogenasen mit ihren jeweiligen Substraten exprimiert wurden. Der Stamm wurde nicht für Enzym-Engineering verwendet und wurde nur auf Redox-Cofaktor-Auxotrophie bewertet.
Abbildung 2: Zentralstoffwechsel
Mutanten mit Defizienz in der NADPH-Oxidation
Es gibt zwei verschiedene Strategien zur Induktion von NADP+-Auxotrophie in E. coli, die auf der Entwicklung des glykolytischen Weges zur Überproduktion von NADPH beruhen. Die erste Strategie beinhaltet die Deletion des nativen gapA-Gens und die Expression einer heterologen NADP+-abhängigen GAPDH, während die zweite Strategie die Umleitung des Kohlenstoffflusses durch den Pentosephosphatweg beinhaltet. Die resultierenden Stämme sind nicht in der Lage, auf Glucose zu wachsen, zeigen aber Wachstum unter verschiedenen Bedingungen, wobei der erste Stamm unter anaeroben Bedingungen und der zweite unter aeroben Bedingungen mit Glycerin als Substrat wächst. Diese Stämme werden für das Engineering von Enzymen mit verbesserten Eigenschaften verwendet, einschließlich Substratspezifität, katalytischer Aktivität und Thermostabilität.
Mutanten mit Defizienz in der NADP+-Reduktion
Drei verschiedene Bakterien, E. coli, P. putida und C. glutamicum, wurden so entwickelt, dass sie NADPH-auxotroph sind, was bedeutet, dass sie exogenes NADPH für das Wachstum benötigen. Im Fall von E. coli und C. glutamicum wurden zentrale Stoffwechselenzyme ausgeschaltet, um die NADP+-Reduktion zu vermeiden, wenn Glucose als Kohlenstoffquelle bereitgestellt wurde, während bei P. putida CRISPR/nCas9-unterstütztes Engineering verwendet wurde, um Sätze von Zielgenen sequenziell zu stören, um ihre Beteiligung am Redoxstoffwechsel zu verstehen. Die NADPH-auxotrophen Stämme wurden dann für wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering basierend auf Cofaktorspezifität verwendet. Eine einzelne Mutageneserunde mit E. coli ergab die bisher effizienteste und spezifischste NADP+-abhängige Formiat-Dehydrogenase, während P. putida und C. glutamicum die ersten Stämme ihrer Art darstellen, die für diese Art von Engineering verwendet werden können.
Mutanten mit Defizienz in der NMN+-Reduktion
Es wurde ein wachstumsgekoppeltes Selektionssystem entwickelt, um Cofaktor-Zyklus und Wachstum basierend auf einem Mangel an NMN+-Reduktion zu verknüpfen. Der E.-coli-SHuffle-Stamm wurde verwendet, der Deletionen in zwei Genen trägt, die an der Produktion von reduziertem Glutathion beteiligt sind. Eine NMNH-abhängige Glutathion-Reduktase wurde durch rationales Mutagenese entwickelt, um den Prozess mit dem NMN+/NMNH-Zyklus zu verknüpfen, und eine NMN+-abhängige Glucose-Dehydrogenase wurde verwendet, um den NMN+/NMNH-Cofaktor-Zyklus und damit das Wachstum zu unterstützen. Die Studie wandte auch erstmals nicht-kanonische Redox-Cofaktor-Auxotrophie für wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering an, was zu einer thermostabilen Phosphit-Dehydrogenase-Variante mit verbesserter katalytischer Effizienz und zeitlicher Stabilität in vitro führte. Die Arbeit liefert einen nützlichen Stamm für wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering, der vom NMN+/NMNH-Zyklus abhängig und auxotroph für den reduzierten Zustand eines nicht-kanonischen Redox-Cofaktors ist.
Das Potenzial der Wachstumskopplung über Redox-Cofaktoren erwies sich als leistungsfähiges Werkzeug zur Entwicklung von Biokatalysatoren, insbesondere im Kontext nachhaltiger Bioproduktion. Obwohl beträchtliche Fortschritte bei der Erzeugung von Redox-Cofaktor-auxotrophen Stämmen erzielt wurden, deutet die Aussage darauf hin, dass es noch mehrere unerforschte Forschungswege gibt. Einer davon betrifft die Entwicklung von Cofaktor-auxotrophen Stämmen anderer Organismen als E. coli, was neue Möglichkeiten für wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering eröffnen könnte.
Insgesamt deutet es darauf hin, dass die Nutzung von Redox-Cofaktor-basierter Wachstumskopplung eine große Chance für die Entwicklung der Biokatalyse darstellt, insbesondere für die Produktion von Produkten, die die Anforderungen anderer Hochdurchsatz-Enzym-Engineering-Ansätze nicht erfüllen können. Es betont die Notwendigkeit, vielseitigere und effizientere Biokatalysatoren für nachhaltige Bioproduktion zu entwickeln und unterstreicht die Bedeutung fortgesetzter Forschung in diesem Bereich.
Referenz: Jochem R. Nielsen a, Ruud A. Weusthuis b, Wei E. Huang a, Wachstumsgekoppeltes Enzym-Engineering durch Manipulation der Redox-Cofaktor-Regeneration, Biotechnology Advances, 2023.
