Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten in den Ischiasnerven der Maus
Einleitung
Die entscheidenden Bestandteile von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) und seine Metaboliten bei Alterung und Neurodegeneration sind weithin anerkannt. Um Fortschritte in der biochemischen Forschung und Interventionen zur Bekämpfung von Alterungs- und neurodegenerativen Erkrankungen voranzutreiben, ist es von großer Bedeutung, NAD+ und seine Metabolitenwerte im NAD+-Rettungsweg genau zu quantifizieren. Hier wird eine robuste und genaue LC-MS/MS-Methode angewandt, um NAD+ und seine Metabolitenspiegel im normalen und verletzten Ischiasnerv der Maus zu quantifizieren.Einschränkungen bestehender Methoden zur Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten
Traditionelle Methoden zur Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten, wie HPLC-UV, NMR, Kapillarzonenelektrophorese oder kolorimetrische enzymatische Tests, stehen vor verschiedenen Herausforderungen bei Sensitivität, Selektivität und indirekter Messung. Was die bestehenden LC-MS/MS-Tests für zelluläre oder Gewebe-NAD+ und dessen Metabolitenmessungen betrifft, so gibt es noch viele Schwierigkeiten zu überwinden, wie verlängerte Laufzeiten, schlechtes chromatografisches Retentionsverhalten und unzufriedenstellende Spitzenformen. Außerdem können nur ein bis drei Substanzen im NAD+-Rettungsweg mit diesen Methoden abgedeckt werden.Die Modifikationen der LC-MS/MS-Methode
Auf Grundlage bestehender LC-MS/MS-Assays werden Änderungen bezüglich der chromatografischen Bedingungen, der Surrogatmatrix und der MS/MS-Bedingungen durchgeführt. Konkret werden 5 μM Methylenphosphonsäure als Mobilphasenadditiv verwendet, was explizit die Signalintensität und Spitzenform fördert. Angesichts der relativ sauberen und einfachen Natur der Nimmer-Proben und ihrer geringen Größe wird ultrareines Wasser als Ersatzmatrix getestet. Anstelle hydrophiler Wechselwirkungs-Flüssigkeitschromatographie-Säule und Hyperkarbonat-Säule wird die Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-Säule verwendet, deren einzigartige MaxPeak HPS Hochleistungs-Oberflächentechnologie (Passivierung der Säuleninnenwand, Eliminierung der Metalloberfläche) die hohe Reproduzierbarkeit, Spitzensymmetrie und Basislinientrennung aller Analyte ermöglicht. Außerdem sind die MS-Bedingungen so optimiert, dass das NAD+-Interferenzsignal im zyklischen Adenosindiphosphat-Ribose (cADPR)-Kanal minimiert wird, während die Antwort von cADPR und Nikotinamidmononukleotid (NMN) aufrechterhalten bleibt, mit 4000 V für Ionensprühspannung, 450 °C für Turboheizer, 50 psi für Gas 1, 50 psi für Gas 2, 30 psi für Gardinengas und 12 psi für Kollisionsgas.
Repräsentatives Chromatogramm von Nervenproben (normal vs. verletzt)
Alle fünf Analyten erreichen eine Baseline-Trennung, wobei cADPR ein sensibler Biomarker im Neurodegenerationsmodell ist. Hier induziert die Ischiasnerv-Axotomie eine axonale Degeneration, was zu einem reduzierten NAD+-Spiegel und einem erhöhten NMN-Wert in den verletzten Nerven führt, was zu einer etwa zweifachen Erhöhung des NMN/NAD+-Verhältnisses führt. Gleichzeitig sinken die Werte von Nikotinamid (NAM) und Adenosindiphosphatribose (ADPR) etwa um das Zweifache, während der cADPR-Wert um mehr als das Achtfache erhöht wird. Diese Ergebnisse stimmen mit den zuvor berichteten Studien überein und bestätigen die Genauigkeit dieser modifizierten LS-MS/MS-Methode bei der Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten.
Fazit
Diese modifizierte LC-MS/MS-Methode ermöglicht eine effektive Basistrennung von NAD+, NMN, NAM, ADPR und cADPR innerhalb einer kurzen Laufzeit von 5 Minuten, was zu frühen Diagnosen verschiedener neurologischer Erkrankungen und zur Entwicklung von Medikamenten für alternde und neurodegenerative Erkrankungen beiträgt.Referenz
Ma Y, Deng L, Du Z. Entwicklung und Validierung einer LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von NAD+ und verwandten Metaboliten in Ischiasnerven von Mäusen sowie deren Anwendung auf ein Tiermodell für Nervenverletzungen. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACseit 2012 widmet sich Forschung und Entwicklung, Herstellung und Verkauf von Rohstoffen für Coenzyme und Naturprodukte, mit eigenständigen Fabriken, über 170 globalen Patenten sowie einem starken F&E-Team. BONTAC verfügt über umfangreiche Erfahrung in Forschung und Entwicklung sowie fortschrittliche Technologien in der Biosynthese vonNAD und seine Vorläufer(z. B. NMN und NR). Es sind verschiedene Arten von NAD auszuwählen, darunter NAD ER Grade (Endoxin-Entfernung), NAD Grade I (IVD/Nahrungsergänzungsmittel/Kosmetik-Rohpulver), NAD Grade II (API/Intermediate) und NAD Grade IV (falls die Löslichkeit höher angeschrieben ist), die in Form von gelystenem oder kristallinem Pulver bereitgestellt werden können. Die Reinheit von BONTAC NAD kann über 98 % erreichen.
