Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten in Ischiasnerven von Mäusen
Einführung
Die entscheidenden Teile von Nicotinamidadenindinukleotid (NAD+) und seinen Metaboliten bei Alterung und Neurodegeneration sind weithin anerkannt. Um Fortschritte in der biochemischen Forschung und bei Interventionen zu fördern, die auf Alterung und neurodegenerative Erkrankungen abzielen, ist es von großer Bedeutung, NAD+ und seine Metaboliten im NAD+-Salvage-Pfad genau zu quantifizieren. Hierbei wird eine robuste und genaue LC-MS/MS-Methode angewendet, um die Konzentrationen von NAD+ und seinen Metaboliten im normalen und verletzten Ischiasnerv der Maus zu quantifizieren.Einschränkungen bestehender Methoden zur Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten
Traditionelle Methoden zur Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten, wie HPLC-UV, NMR, Kapillarzonenelektrophorese oder kolorimetrische enzymatische Assays, stehen vor verschiedenen Herausforderungen in Bezug auf Empfindlichkeit, Selektivität und indirekte Messung. Bei bestehenden LC-MS/MS-Assays für zelluläre oder gewebliche NAD+- und Metabolitenmessungen gibt es noch viele Schwierigkeiten zu überwinden, wie verlängerte Laufzeiten, schlechtes chromatographisches Retentionsverhalten und unbefriedigende Peakformen. Darüber hinaus können mit diesen Methoden nur ein bis drei Substanzen im NAD+-Salvage-Pfad abgedeckt werden.Die Modifikationen der LC-MS/MS-Methode
Auf der Grundlage bestehender LC-MS/MS-Assays werden Modifikationen hinsichtlich der chromatographischen Bedingungen, der Ersatzmatrix und der MS/MS-Bedingungen durchgeführt. Insbesondere wird 5 μM Methylenphosphonsäure als Zusatz zur mobilen Phase verwendet, was die Signalintensität und Peakform deutlich fördert. Angesichts der relativ sauberen und einfachen Natur von Nervenproben und ihrer geringen Größe wird Reinstwasser als Ersatzmatrix getestet. Anstelle einer hydrophilen Interaktionschromatographie-Säule und einer Hypercarb-Säule wird die Waters Atlantis Premier BEH C18 AX-Säule verwendet, deren einzigartige MaxPeak-HPS-Hochleistungsoberflächentechnologie (Passivierung der Säuleninnenwand, Eliminierung von Metalloberflächen) eine hohe Reproduzierbarkeit, Peaksymmetrie und Basislinientrennung aller Analyten ermöglicht.Darüber hinaus werden die MS-Bedingungen optimiert, um das NAD+-Interferenzsignal im Kanal für cyclisches Adenosin-Diphosphat-Ribose (cADPR) zu minimieren, während die Antwort von cADPR und Nicotinamidmononukleotid (NMN) aufrechterhalten wird, mit 4000 V für die Ionspray-Spannung, 450 °C für die Turboheizer-Temperatur, 50 psi für Gas 1, 50 psi für Gas 2, 30 psi für Curtain-Gas und 12 psi für Kollisionsgas.
Repräsentatives Chromatogramm von Nervenproben (normal vs. verletzt)
Alle fünf Analyten erreichen eine Basislinientrennung, wobei cADPR ein empfindlicher Biomarker im Neurodegenerationsmodell ist. Hierbei induziert die Axotomie des Ischiasnervs eine axonale Degeneration, was zu einem reduzierten NAD+-Spiegel und einem erhöhten NMN-Spiegel in den verletzten Nerven führt, was zu einer etwa 2-fachen Erhöhung des NMN/NAD+-Verhältnisses führt. Gleichzeitig werden die Spiegel von Nicotinamid (NAM) und Adenosin-Diphosphat-Ribose (ADPR) um etwa das 2-fache verringert, während der cADPR-Spiegel um mehr als das 8-fache erhöht wird. Diese Ergebnisse stimmen mit denen früherer veröffentlichter Forschung überein und bestätigen die Genauigkeit dieser modifizierten LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von NAD+ und seinen Metaboliten.
Fazit
Diese modifizierte LC-MS/MS-Methode ermöglicht eine effektive Basislinientrennung von NAD+, NMN, NAM, ADPR und cADPR innerhalb einer kurzen Laufzeit von 5 Minuten, was zu frühen Diagnosen verschiedener neurologischer Störungen und zur Arzneimittelentwicklung für Alterung und neurodegenerative Erkrankungen beiträgt.Referenz
Ma Y, Deng L, Du Z. Entwicklung und Validierung einer LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung von NAD+ und verwandten Metaboliten in Ischiasnerven von Mäusen und ihre Anwendung auf ein Tiermodell für Nervenverletzungen. J Chromatogr A. doi:10.1016/j.chroma.2024.464821BONTAC NAD
BONTACwidmet sich seit 2012 der Forschung, Entwicklung, Herstellung und dem Verkauf von Rohstoffen für Coenzyme und Naturprodukte, mit eigenen Fabriken, über 170 weltweiten Patenten sowie einem starken F&E-Team. BONTAC verfügt über umfangreiche F&E-Erfahrung und fortschrittliche Technologie in der Biosynthese vonNAD und seinen Vorstufen(z. B. NMN und NR). Es gibt verschiedene Arten von NAD zur Auswahl, darunter NAD ER Grade (Endotoxin-Entfernung), NAD Grade I (IVD/Nahrungsergänzungsmittel/Kosmetik-Rohpulver), NAD Grade II (API/Zwischenprodukte) und NAD Grade IV (falls höhere Anforderungen an die Löslichkeit bestehen), die in Form von lyophilisiertem Pulver oder kristallinem Pulver geliefert werden können. Die Reinheit von BONTAC NAD kann über 98 % erreichen.
