Die Optimierung der Reaktionsbedingungen zur Erreichung einer hohen Ausbeute von Stevia Rebaudiosid d
Zuckerreiche Diäten haben zu einer steigenden Prävalenz verschiedener chronischer Krankheiten geführt, darunter Fettleibigkeit, Diabetes, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Bluthochdruck, was ein erhebliches globales Gesundheitsproblem darstellt. Stevia Rebaudioside D (Reb D), ein natürlicher Süßstoff, der aus Pflanzen gewonnen wird, hat als Zuckerersatz aufgrund seines kalorienfreien Gehalts, seiner intensiven Süße und seines angenehmen Geschmacksprofils große Aufmerksamkeit erlangt.
Seine begrenzte Präsenz in der Stevia rebaudiana Bertoni und Herausforderungen im Zusammenhang mit geringer Löslichkeit und enzymatischer Aktivität pflanzlicher Glycosyltransferase haben jedoch ihre breite kommerzielle Anwendung behindert. Als Reaktion auf diese Probleme wurde eine neuartige Glykosyltransferase namens YojK, die aus Bacillus subtilis 168 stammt, entdeckt. Diese Studie führt eine genetisch veränderte bakterielle Glykosyltransferase, YojK-I241T/G327N, ein, die durch hohe Löslichkeit und katalytische Effizienz gekennzeichnet ist und großes Potenzial für die industrielle Produktion von Reb D bietet.
Die Entwicklung einer hocheffizienten Methode zur Herstellung von Rebaudiosid D unter Verwendung einer Kaskadereaktion von YojK-I241T/G327N- und AtSuSy-Enzymen.
Um das Problem der geringen Löslichkeit in pflanzlich abgeleiteten Glykosyltransferasen anzugehen, untersuchten Forscher das Potenzial der Verwendung von YojK, einer O-Glykosyltransferase aus Bacillus subtilis 168. YojK wurde wegen seiner nachgewiesenen Glykosylierungsaktivität mit verschiedenen Substraten, einschließlich großer Moleküle, ausgewählt. Nach erfolgreicher rekombinanter Expression und Reinigung wurde YojK eingesetzt, um Reb A zu glykosylieren, was zur Produktion von Stevia Reb D führte. Die kinetische Analyse der Enzyme zeigte, dass YojK eine geringere katalytische Aktivität gegenüber Reb D aufweist als andere Glykosyltransferasen. Folglich legt die Studie nahe, dass strukturgelenkte Technik notwendig ist, um YojKs katalytische Aktivität für potenzielle praktische Anwendungen zu verbessern. (wie in Abbildung 1 dargestellt)
Abbildung 1
Die Optimierung der Reaktionsbedingungen zur Erreichung einer hohen Ausbeute von Rebaudiosid D.
Die Reaktionsbedingungen, einschließlich pH, Temperatur und Substratkonzentration, können optimiert werden, um eine hohe Ausbeute von Srevia Reb D zu erzielen. Die Studie nutzte molekulare dynamische Simulationen, um zu untersuchen, wie die YojK-I241T/G327N-Variante die Reb-D-Glykosylierung verbessert. Die Variante hielt während der Simulationen eine stabile Wasserstoffbrücke zwischen Reb A und H14, im Gegensatz zum Wildtyp (wie in Abbildung 2 dargestellt). Diese Stabilität erstreckte sich auch auf den Abstand zwischen dem O2-Atom von Reb A und dem C1P von UDPG. Die verbesserte katalytische Effizienz der YojK-I241T/G327N-Variante wurde auf diese stabilen Wechselwirkungen zurückgeführt, was auf ihr praktisches Potenzial hindeutet.
Abbildung 2
Abbildung 3
Fazit
Dieser Ansatz ergab 83,47 % Reb D. Bemerkenswert ist, dass die Zugabe von 1 mM UDPG die Synthese von 20,59 g/L Reb D mit einer bemerkenswerten Ausbeute von 91,29 % ermöglichte, was frühere Studien übertraf. Dieser Prozess zeigt das Potenzial für die industrielle Reb D-Produktion, insbesondere nach der Tragwerksplanung von YojK.YojK kann effizient in E. coli BL21 (DE3) mit hoher Löslichkeit exprimiert werden. Durch strukturgesteuerte Technik wurde ein Doppelmutant, YojK-I241T/G327N, entwickelt, der die Großproduktion von Reb D mit einer außergewöhnlichen Ausbeute von 91,29 % durch Recycling von UDPG, katalysiert durch Saccharosesynthase AtSuSy, ermöglichte. Diese Studie präsentiert YojK-I241T/G327N als vielversprechendes Werkzeug für wirtschaftlich effektive industrielle Reb D-Produktion.
